طراحی و ساخت داربست نانوکامپوزیتی plga/کیتوزان و ارزیابی تمایز سلول های بنیادی مزانشیمی بر روی آن جهت مهندسی بافت عصب

در سال های اخیر با گسترش علم بین رشته ای مهندسی بافت که تلفیقی از به کارگیری روش های سلولی، مهندسی و علم مواد در ساخت بافت های زنده است، روزنه ی امیدی برای درمان و ترمیم ضایعات بافتی و نقص عضو پدید آمده است. با استفاده از این فناوری، سلول های ناحیه ای از بدن یا سلول های بنیادی را در محیط خارج بدن کشت داده و سپس مجتمع سلولی رشد کرده و یا تمایزیافته را وارد بدن فرد بیمار می کنند. در بیشتر مواقع، تکثیر و تمایز سلول ها بر روی بسترهایی صورت می گیرد که تقلیدی از ماتریکس خارج سلولی سلول های حیوانی است. این بسترهای مهندسی بافت از جنس پلیمرهای مصنوعی و طبیعی می باشند. پلی لاکتیک گلیکولیک اسید (plga) و کیتوزان به ترتیب از دسته ی پلیمرهای مصنوعی و طبیعی متداول برای کاربردهای مهندسی بافت هستند. در این پژوهش با استفاده از دو روش، داربست مهندسی بافت نانوبیوکامپوزیتی plga/cs تهیه شد. در روش اول نانوذرات کیتوزان تهیه شده به روش ژل شدن یونی در محلول پلیمری plga به صورت یکنواخت توزیع شده و به روش الکتروریسی تک مرحله ای با استفاده از یک سرنگ ریسیده شد. در روش دوم تهیه ی نانوذرات کیتوزان از محلول کیتوزان به روش الکترواسپری بهینه سازی شد و با استفاده از دو سرنگ به طور همزمان این نانوبیوکامپوزیت تهیه شد. در این روش، الکترواسپری نانوذرات کیتوزان بر روی نانوالیاف plga در حال جمع آوری بر روی درام به طور همزمان، نانوبیوکامپوزیتی یکنواخت حاصل شد. این داربست ها با سه نسبت مختلف plga/cs 30/70، 20/80 و 10/90 به هر دو روش با موفقیت ساخته شد. در همه نسبت های ذکرشده و به هر دو روش، الیافی با آرایش تصادفی و هم راستا تهیه شد و مشخصه های فیزیکی- شیمیایی داربست های تهیه شده به روش های مختلف ارزیابی شد. روش های مورد استفاده در مشخصه یابی داربست عبارت اند از: مشاهده مورفولوژی الیاف توسط میکروسکوپ الکترونی روبشی (sem) و همچنین میکروسکوپ الکترونی عبوری (tem)، تعیین میزان جذب بافر فسفات (pbs) تحت عنوان نسبت تورم، تعیین زاویه ی تماس آب با سطح داربست، اندازه گیری خواص مکانیکی، زیست تخریب پذیری داربست در محیط بیولوژیکی خارج از بدن، طیف سنجی مادون قرمز (ftir)، اسپکتروسکوپی فوتوالکترونی اشعه ایکس (xps) و مطالعه ی خواص حرارتی داربست. نتایج حاصل شده در این بخش نشان داد در حالت بهینه، کمترین میانگین قطر الیاف در روش تک سرنگی و در داربست plga/cs با نسبت 30/70، معادل nm 286 در الیاف با آرایش هم راستا به دست آمد. درصد تورم این داربست به عنوان معیاری از آبدوستی برابر 10/11 ± 57/305 درصد و میزان تخریب نمونه در محیط بیولوژیک خارج از بدن در مدت یک ماه 35-30 درصد حاصل شد. استحکام کششی، مدول یانگ و درصد ازدیاد طول به ترتیب برابر 19/1 ± 40/13 و 29/0 ± 00/3 مگاپاسکال و 8/1 ± 0/36 درصد برای این داربست به دست آمد. در بخش سلولی، پس از استخراج سلول های بنیادی از بافت چربی، این سلول ها جهت ارزیابی تمایزشان به سلول شوان استفاده شد. پس از ارزیابی سازگاری زیستی این سلول ها با داربست های تهیه شده، در ادامه تمایز سلول های بنیادی مزانشیمی به سلول های شوان بر روی داربست ها با خواص بهینه مطالعه شد. سپس اثر پارامترهای مختلف بر رشد و تکثیر و تمایز سلول های بنیادی مزانشیمی بررسی شد. پس از بهینه سازی نهایی خواص داربست و رشد و تکثیر و تمایز سلول ها بر روی آن، تمایز سلول های بنیادی به سلول های شوان از نظر ایمونوسایتوشیمی اثبات شد و این محصول به عنوان فرآورده ی مهندسی بافت بهینه جهت ترمیم ضایعات اعصاب محیطی معرفی شد. روش های مورد استفاده در این بخش شامل بررسی میزان چسبندگی سلول ها به داربست، ارزیابی میزان بقاء سلول ها و تکثیر سلولی از طریق روش mtt و ارزیابی میزان سلول های تمایزیافته است. جهت بررسی درصد سلول های تمایزیافته به سلول های شوان از روش رنگ آمیزی ایمونوفلورسنت مارکرهایgfap، mbp، s100 استفاده شد و نتایج نشان داد بیشترین درصد بیان مارکرهای اختصاصی ذکرشده در داربست plga/cs تهیه شده به روش تک سرنگی با نسبت 30/70 با آرایش الیاف هم راستا به ترتیب برابر 5/89، 7/85 و 1/96 درصد حاصل شد. هر مرحله از آزمایش ها سه بار تکرار شد و آنالیز آماری داده ها با استفاده از نرم افزار spss-17 و تجزیه و تحلیل یافته ها با استفاده از روش anova one way انجام شد. این نتایج نشان داد که داربست های plga/cs با آرایش الیاف هم راستا قابلیت کاربرد وسیع جهت ترمیم و بازسازی اعصاب محیطی دارند.